同型半胱氨酸修饰甲基-Cp G结合蛋白2与自闭症谱系障碍相关
发布时间：2021-01-13 点击：
发布：本期刊
摘 要：目的 探讨高浓度的同型半胱氨酸(Hcy)在自闭症谱系障碍(ASD)发病中的可能机制。方法 ASD患儿和对照组c DNA样本来自本课题组前期研究，实验中的细胞株包括人胚肾上皮细胞系HEK-293T、小鼠神经干细胞系NE-4C和小鼠海马神经元细胞系HT22，实验动物为野生型C57BL/6J小鼠。采用实时荧光定量PCR比较ASD患儿和对照组外周血c DNA中甲硫氨酰-tRNA合成酶(MARS)表达水平;串联亲和纯化法检测与MARS存在互作关系的转录因子;免疫沉淀和液相质谱法研究Hcy对该转录因子的修饰作用以及可能的赖氨酸残基修饰位点; Ch IP实验在细胞系和小鼠中验证该转录因子与其下游靶基因启动子的结合受MARS或Hcy的影响;比较ASD患儿和对照组c DNA样本中这些靶基因的转录水平。结果 ①ASD患儿的MARS转录水平高于对照组(P<0.01),MARS与MeCP2互作;②Hcy可修饰到MeCP2的7个赖氨酸残基位点上，以此抑制MeCP2与DNA甲基化Cp G结合，使受MeCP2调控的下游神经发育基因GRIN2A、BDNF等转录水平上调(P<0.01);③42.9%ASD患儿GRIN2A、BDNF、EAAT1～4基因转录水平高于对照组均值; ASD患儿EAAT2、EAAT4基因平均转录水平高于对照组(P<0.05)。结论 高MARS表达水平和Hcy浓度使MeCP2被Hcy修饰，降低了MeCP2蛋白与DNA甲基化Cp G的结合活性，从而影响MeCP2下游神经发育基因的转录水平。
关键词：自闭症谱系障碍 同型半胱氨酸修饰 甲基-CpG结合蛋白2
近年来，自闭症谱系障碍(ASD)的发病率呈现持续上升的趋势[1]。ASD的生物学基础复杂。有研究报道，ASD患者的同型半胱氨酸(Hcy)水平在幼年和成年阶段均显著高于正常范围[2,3]。本课题组前期研究发现，异常激活的甲硫氨酰-tRNA合成酶(MARS)将Hcy错误编辑为高能同型半胱氨酸硫代内酯(HTL)，对相关蛋白形成N-Hcy修饰，从而使蛋白功能受到影响[4]。本文通过研究受N-Hcy修饰影响的蛋白及其功能改变，进一步探讨ASD的潜在发生机制。
ASD患儿和对照组儿童外周血c DNA样本来自本课题组前期研究[5]。
1.2 细胞株和动物来源
人胚肾上皮细胞系HEK-293T和小鼠神经干细胞NE-4C细胞系均来自中科院典型培养物保藏委员会细胞库，小鼠海马神经元细胞系HT22来自中国微生物菌种查询网，野生型C57BL/6J小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。
1.3 实时荧光定量PCR
将NE-4C细胞用不同浓度梯度(0、0.25、0.50、1.00 mmol·L-1) Hcy处理25 h，抽提细胞RNA并行反转录(诺唯赞公司反转录试剂盒)。以β-actin和GAPDH作为内参，利用在线软件Primer Bank(https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)设计MARS、GRIN2A、BDNF、EAAT1～4基因的引物，用荧光定量PCR试剂盒(诺唯赞公司)进行检测。
1.4 串联亲和纯化法
检测MARS互作蛋白的TAP法参考本课题组前期研究[6]。
1.5 免疫沉淀
为检测Hcy对Me CP2的修饰，将NE-4C细胞用4 mmol·L-1Hcy处理，收集细胞裂解液，加入碘乙酰胺保护巯基，取上清并与Me CP2抗体(Abcam公司，货号ab2828)和G蛋白孵育，沉淀后收集Hcy处理的Me CP2蛋白，一部分经胰酶酶切、干燥后用于液相质谱实验，一部分用于蛋白质免疫印迹实验，检测Me CP2的Hcy修饰情况。Hcy修饰抗体为实验室自制[6]。
1.6 凝胶迁移实验(EMSA)
为检测Hcy修饰对Me CP2功能的影响，用带羧基荧光素(FAM)标签的甲基化、非甲基化DNA和Me CP2、HTL(0、1、4 mmol·L-1)互作，反应后用于DNA印迹实验。
1.7 染色质免疫共沉淀(Ch IP)
为检测Hcy修饰对Me CP2转录调控功能的影响，分别用Hcy、过表达MARS处理HEK293T细胞，收集细胞裂解液用于Ch IP实验;并以高浓度Hcy饲料饲喂C57BL/6J小鼠，取脑组织用于Ch IP实验。
1.8 统计学方法
实验结果采用双尾非配对t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
实时荧光定量PCR(图1A)显示，ASD组外周血c DNA中MARS水平高于对照组(P<0.01)。串联亲和纯化法检测发现，Me CP2是与MARS存在互作关系的转录因子。
2.2 Hcy自发修饰Me CP2并抑制其活性
免疫沉淀结果(图1B)显示，NE-4C细胞内Me CP2能够被Hcy自发修饰。液相质谱(图1C)检测到7个可能被Hcy修饰的赖氨酸残基位点，其中K82、K130在甲基Cp G结合结构域(MBD),K271在转录抑制域(TRD)。
图1 ASD患儿血液MARS转录水平以及Hcy自发修饰Me CP2
注A:实时荧光定量PCR检测，1)**:P<0.01;B:免疫沉淀实验;C:Me CP2中被Hcy修饰的赖氨酸残基位点，黑色箭头指向Hcy在Me CP2上的赖氨酸修饰位点
EMSA结果(图2A)显示，Me CP2发生HTL化后，其与DNA甲基化Cp G结构域的结合能力受到明显抑制。
用受Me CP2转录调控的BDNF和GRIN2A基因的启动子进行Ch IP实验。图2B显示，HEK293T细胞过表达MARS或用Hcy处理后，与Me CP2互作的靶基因启动子均显著减少，且共同处理有加和作用;高浓度Hcy饲料喂养后，小鼠脑组织Me CP2与BDNF和GRIN2A基因启动子共沉淀显著减少。
实时荧光定量PCR结果(图2C)显示，在NE-4C和HT22细胞株中，分别用不同浓度梯度Hcy处理，GRIN2A、BDNF转录水平均显著高于对照组。
2.3 ASD患儿血液中Me CP2下游基因的转录水平异常
实时荧光定量PCR在对照组和ASD组各检测了14个c DNA样本，42.9%ASD患儿中GRIN2A、BDNF、EAAT1～4基因转录水平高于对照组均值;ASD患儿EAAT2、EAAT4基因平均转录水平高于对照组，差异有统计学意义;在分析样本中(n=28) GRIN2A和BDNF转录水平正相关(r=0.984,t=39.667)。高转录EAAT1～4的ASD患儿中GRIN2A、BDNF转录水平亦较高。
图2 N-Hcy抑制Me CP2活性
注A EMSA实验，Hcy修饰Me CP2后抑制其与DNA甲基化CpG结构域结合;B ChIP实验观察Hcy、MARS处理对Me CP2结合BDNF、GRIN2A基因启动子活性的影响;C实时荧光定量PCR检测Hcy、MARS处理对小鼠神经细胞Bdnf、Grin2a表达水平的影响。1) P<0.05,2)P<0.01,3) P<0.001,4)单位:mmol·L-1
本研究发现，高MARS表达水平和Hcy浓度使Me CP2被HTL修饰，共价赖氨酸-Hcy化形成Me CP2-K-Hcy，被修饰的Me CP2蛋白与DNA甲基化Cp G的结合活性降低，从而影响Me CP2下游神经发育基因的转录水平，使GRIN2A、BDNF等的转录水平增加。由此认为，Me CP2在无突变的情况下被表观遗传修饰的程度，即Hcy对Me CP2的修饰水平和MARS表达异常可能是部分神经发育疾病(如ASD)的关键致病因素。
本研究从体内修饰机制和患儿样本检测2方面探究高K-Hcy浓度与个体患ASD的可能联系，发现ASD患儿Me CP2下游基因转录调控异常可能与Hcy对Me CP2的修饰相关，且ASD患儿血液中MARS表达水平显著升高。此外，ASD患儿中存在一个群体，其GRIN2A、BDNF、EAATs等受Me CP2蛋白调控的靶基因为高转录水平，可能指向ASD中尚未分类的某种神经发育疾病。
参考文献
[1]Maenner MJ,Shaw KA,Baio J,et al. Prevalence of Autism spectrum disorder among children aged 8 years-Autism and developmental disabilities monitoring network,11 sites,United States,2016. MMWR Surveill Summ,2020,69(4):1-12.
[2]孙艺，梁爽，孙彩虹，等．孤独症谱系障碍患儿血清叶酸及其代谢产物与维生素B12水平状况．中国学校卫生，2018,39(3):331-334.
[3]Fuentes-Albero M,Cauli O. Homocysteine levels in autism spectrum disorder:a clinical update. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets,2018,18(4):289-296.
[4]Mei X,Qi D,Zhang T,et al. Inhibiting MARSs reduces hyperhomocysteinemia-associated neural tube and congenital heart defects. EMBO Mol Med,2020,12(3):e9469.
[5]杨曹骅，杜亚松，刘文文，等．核心家系孤独症患儿FOXP1基因的突变及CNV分析．中国儿童保健杂志，2013,21(6):567-570.
[6]Wang D,Zhao R,Qu YY,et al. Colonic lysine homocysteinylation induced by high-fat diet suppresses DNA damage repair. Cell Rep,2018,25(2):398-412. e6.
[7]Ali A,Waly MI,Al-Farsi YM,et al. Hyperhomocysteinemia among Omani autistic children:a case-control study. Acta Biochim Pol,2011,58(4):547-551.
[8]Jakubowski H,Zhang L,Bardeguez A,et al. Homocysteine thiolactone and protein homocysteinylation in human endothelial cells:implications for atherosclerosis. Circ Res,2000,87(1):45-51.
[9]Swanberg SE,Nagarajan RP,Peddada S,et al. Reciprocal coregulation of EGR2 and MECP2 is disrupted in Rett syndrome and autism. Hum Mol Genet,2009,18(3):525-534.
[10]Gonzales ML,Lasalle JM. The role of Me CP2 in brain development and neurodevelopmental disorders. Curr Psychiatry Rep,2010,12(2):127-134.
关键词：自闭症谱系障碍 同型半胱氨酸修饰 甲基-CpG结合蛋白2
近年来，自闭症谱系障碍(ASD)的发病率呈现持续上升的趋势[1]。ASD的生物学基础复杂。有研究报道，ASD患者的同型半胱氨酸(Hcy)水平在幼年和成年阶段均显著高于正常范围[2,3]。本课题组前期研究发现，异常激活的甲硫氨酰-tRNA合成酶(MARS)将Hcy错误编辑为高能同型半胱氨酸硫代内酯(HTL)，对相关蛋白形成N-Hcy修饰，从而使蛋白功能受到影响[4]。本文通过研究受N-Hcy修饰影响的蛋白及其功能改变，进一步探讨ASD的潜在发生机制。
1 方法
1.1 人体样本来源ASD患儿和对照组儿童外周血c DNA样本来自本课题组前期研究[5]。
1.2 细胞株和动物来源
人胚肾上皮细胞系HEK-293T和小鼠神经干细胞NE-4C细胞系均来自中科院典型培养物保藏委员会细胞库，小鼠海马神经元细胞系HT22来自中国微生物菌种查询网，野生型C57BL/6J小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。
1.3 实时荧光定量PCR
将NE-4C细胞用不同浓度梯度(0、0.25、0.50、1.00 mmol·L-1) Hcy处理25 h，抽提细胞RNA并行反转录(诺唯赞公司反转录试剂盒)。以β-actin和GAPDH作为内参，利用在线软件Primer Bank(https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)设计MARS、GRIN2A、BDNF、EAAT1～4基因的引物，用荧光定量PCR试剂盒(诺唯赞公司)进行检测。
1.4 串联亲和纯化法
检测MARS互作蛋白的TAP法参考本课题组前期研究[6]。
1.5 免疫沉淀
为检测Hcy对Me CP2的修饰，将NE-4C细胞用4 mmol·L-1Hcy处理，收集细胞裂解液，加入碘乙酰胺保护巯基，取上清并与Me CP2抗体(Abcam公司，货号ab2828)和G蛋白孵育，沉淀后收集Hcy处理的Me CP2蛋白，一部分经胰酶酶切、干燥后用于液相质谱实验，一部分用于蛋白质免疫印迹实验，检测Me CP2的Hcy修饰情况。Hcy修饰抗体为实验室自制[6]。
1.6 凝胶迁移实验(EMSA)
为检测Hcy修饰对Me CP2功能的影响，用带羧基荧光素(FAM)标签的甲基化、非甲基化DNA和Me CP2、HTL(0、1、4 mmol·L-1)互作，反应后用于DNA印迹实验。
1.7 染色质免疫共沉淀(Ch IP)
为检测Hcy修饰对Me CP2转录调控功能的影响，分别用Hcy、过表达MARS处理HEK293T细胞，收集细胞裂解液用于Ch IP实验;并以高浓度Hcy饲料饲喂C57BL/6J小鼠，取脑组织用于Ch IP实验。
1.8 统计学方法
实验结果采用双尾非配对t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 ASD患儿血液MARS转录水平升高实时荧光定量PCR(图1A)显示，ASD组外周血c DNA中MARS水平高于对照组(P<0.01)。串联亲和纯化法检测发现，Me CP2是与MARS存在互作关系的转录因子。
2.2 Hcy自发修饰Me CP2并抑制其活性
免疫沉淀结果(图1B)显示，NE-4C细胞内Me CP2能够被Hcy自发修饰。液相质谱(图1C)检测到7个可能被Hcy修饰的赖氨酸残基位点，其中K82、K130在甲基Cp G结合结构域(MBD),K271在转录抑制域(TRD)。
图1 ASD患儿血液MARS转录水平以及Hcy自发修饰Me CP2
注A:实时荧光定量PCR检测，1)**:P<0.01;B:免疫沉淀实验;C:Me CP2中被Hcy修饰的赖氨酸残基位点，黑色箭头指向Hcy在Me CP2上的赖氨酸修饰位点
EMSA结果(图2A)显示，Me CP2发生HTL化后，其与DNA甲基化Cp G结构域的结合能力受到明显抑制。
用受Me CP2转录调控的BDNF和GRIN2A基因的启动子进行Ch IP实验。图2B显示，HEK293T细胞过表达MARS或用Hcy处理后，与Me CP2互作的靶基因启动子均显著减少，且共同处理有加和作用;高浓度Hcy饲料喂养后，小鼠脑组织Me CP2与BDNF和GRIN2A基因启动子共沉淀显著减少。
实时荧光定量PCR结果(图2C)显示，在NE-4C和HT22细胞株中，分别用不同浓度梯度Hcy处理，GRIN2A、BDNF转录水平均显著高于对照组。
2.3 ASD患儿血液中Me CP2下游基因的转录水平异常
实时荧光定量PCR在对照组和ASD组各检测了14个c DNA样本，42.9%ASD患儿中GRIN2A、BDNF、EAAT1～4基因转录水平高于对照组均值;ASD患儿EAAT2、EAAT4基因平均转录水平高于对照组，差异有统计学意义;在分析样本中(n=28) GRIN2A和BDNF转录水平正相关(r=0.984,t=39.667)。高转录EAAT1～4的ASD患儿中GRIN2A、BDNF转录水平亦较高。
图2 N-Hcy抑制Me CP2活性
注A EMSA实验，Hcy修饰Me CP2后抑制其与DNA甲基化CpG结构域结合;B ChIP实验观察Hcy、MARS处理对Me CP2结合BDNF、GRIN2A基因启动子活性的影响;C实时荧光定量PCR检测Hcy、MARS处理对小鼠神经细胞Bdnf、Grin2a表达水平的影响。1) P<0.05,2)P<0.01,3) P<0.001,4)单位:mmol·L-1
3 讨论
有研究显示，血清高浓度Hcy可作为早期临床诊断ASD的生物标志物，也是叶酸依赖性甲硫氨酸循环受损的指标[7]。Hcy在MARS的催化下错误编辑为HTL[8]。HTL可自发修饰到蛋白质的高能赖氨酸残基上，影响蛋白质功能而致病[4]。Me CP2是作用于神经发育基因(如BDNF、GRIN2A)的转录调控因子[9]，对新生儿大脑发育起重要表观遗传调控作用。在许多神经发育障碍中均检测到Me CP2基因的拷贝数变异和突变[10]。研究报道，在ASD患儿大脑皮质中Me CP2表达水平常降低[9]。本研究发现，高MARS表达水平和Hcy浓度使Me CP2被HTL修饰，共价赖氨酸-Hcy化形成Me CP2-K-Hcy，被修饰的Me CP2蛋白与DNA甲基化Cp G的结合活性降低，从而影响Me CP2下游神经发育基因的转录水平，使GRIN2A、BDNF等的转录水平增加。由此认为，Me CP2在无突变的情况下被表观遗传修饰的程度，即Hcy对Me CP2的修饰水平和MARS表达异常可能是部分神经发育疾病(如ASD)的关键致病因素。
本研究从体内修饰机制和患儿样本检测2方面探究高K-Hcy浓度与个体患ASD的可能联系，发现ASD患儿Me CP2下游基因转录调控异常可能与Hcy对Me CP2的修饰相关，且ASD患儿血液中MARS表达水平显著升高。此外，ASD患儿中存在一个群体，其GRIN2A、BDNF、EAATs等受Me CP2蛋白调控的靶基因为高转录水平，可能指向ASD中尚未分类的某种神经发育疾病。
参考文献
[1]Maenner MJ,Shaw KA,Baio J,et al. Prevalence of Autism spectrum disorder among children aged 8 years-Autism and developmental disabilities monitoring network,11 sites,United States,2016. MMWR Surveill Summ,2020,69(4):1-12.
[2]孙艺，梁爽，孙彩虹，等．孤独症谱系障碍患儿血清叶酸及其代谢产物与维生素B12水平状况．中国学校卫生，2018,39(3):331-334.
[3]Fuentes-Albero M,Cauli O. Homocysteine levels in autism spectrum disorder:a clinical update. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets,2018,18(4):289-296.
[4]Mei X,Qi D,Zhang T,et al. Inhibiting MARSs reduces hyperhomocysteinemia-associated neural tube and congenital heart defects. EMBO Mol Med,2020,12(3):e9469.
[5]杨曹骅，杜亚松，刘文文，等．核心家系孤独症患儿FOXP1基因的突变及CNV分析．中国儿童保健杂志，2013,21(6):567-570.
[6]Wang D,Zhao R,Qu YY,et al. Colonic lysine homocysteinylation induced by high-fat diet suppresses DNA damage repair. Cell Rep,2018,25(2):398-412. e6.
[7]Ali A,Waly MI,Al-Farsi YM,et al. Hyperhomocysteinemia among Omani autistic children:a case-control study. Acta Biochim Pol,2011,58(4):547-551.
[8]Jakubowski H,Zhang L,Bardeguez A,et al. Homocysteine thiolactone and protein homocysteinylation in human endothelial cells:implications for atherosclerosis. Circ Res,2000,87(1):45-51.
[9]Swanberg SE,Nagarajan RP,Peddada S,et al. Reciprocal coregulation of EGR2 and MECP2 is disrupted in Rett syndrome and autism. Hum Mol Genet,2009,18(3):525-534.
[10]Gonzales ML,Lasalle JM. The role of Me CP2 in brain development and neurodevelopmental disorders. Curr Psychiatry Rep,2010,12(2):127-134.
