宏基因组Nanopore测序在儿童呼吸道病原微生物快速检测中的应用价值
发布时间：2021-01-13 点击：
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摘 要：目的 探索宏基因组Nanopore(三代)测序在儿童呼吸道病原微生物快速检测中的应用价值。方法 对收集的1例重症肺炎患儿的肺泡灌洗液标本，传统方法检测为腺病毒抗原阳性，肺炎支原体和EB病毒PCR检测阳性，患儿经治疗痊愈出院。以此肺泡灌洗液标本提取DNA后，分别行宏基因组三代和二代测序。建立微生物参考基因组数据库，建立三代测序数据实时分析流程，分别将三代和二代测序数据和参考数据库比对，检测并鉴定病原微生物。结果 三代、二代测序和传统方法检测从收到样本至检出腺病毒用时分别为3.2 h、55.5 h和48 h，检测费用人民币4 200、3 600和1 790元。三代测序在开始后的12 min即检出1 093条腺病毒序列，测序完成后，共得到4 920 000条序列，检出腺病毒99 284条序列，占总序列数的2.02%;检出肺炎支原体和EB病毒序列各1条。二代测序检出的微生物组成和三代类似。结论 宏基因组三代测序能实现对所有潜在儿童呼吸道病原微生物的快速实时检测。
关键词：Nanopore测序 宏基因组测序 腺病毒 儿童呼吸道感染
呼吸道感染是导致5岁以下儿童死亡的重要原因[1,2]。呼吸道感染病原的快速、准确鉴定对于制定有效的抗生素治疗方案具有重要意义[3]。传统病原检测方法具有检测周期长、检测范围窄、阳性率低的缺点[4]。
宏基因组测序对样本中的所有微生物核酸进行测序，这种非靶向的策略可以检测所有潜在的病原，包括罕见病原或新发病原[4-6]，故被广泛应用于临床各类感染性疾病的诊断中[7-9]。宏基因组测序的平台包括Illumina(二代)和Nanopore(三代)测序。二代测序的建库步骤繁琐，测序时间长，数据不能实时分析[9-11]。三代测序具有建库时间短、测序系列长、实时数据分析的特点[8,12,13]，对于病情危重，需要尽快明确病原、疑似新发病原或者特殊病原的诊断具有重要意义[14,15]。Charalampons等[8]利用三代测序的这些特点，通过去宿主反向富集微生物核酸的方式，实现了对成人呼吸道病原6 h的快速诊断。本研究以1例重症肺炎患儿的肺泡灌洗液标本为例，比较三代测序、二代测序和传统检测方法在检测结果、时间和成本等方面的优、缺点。
培养和菌株鉴定使用VITEK2自动分析仪完成，PCR荧光定量检测试剂盒(达安基因)检测肺炎支原体、巨细胞病毒、EB病毒，直接免疫荧光法检测腺病毒(美国Diagnostic Hybrids)，按照说明书进行操作。
1.2 宏基因组测序
宏基因检测得到复旦大学附属儿科医院(我院)伦理委员会批准(编号:2019-300)。利用患儿肺泡灌洗液样本传统检测后剩余标本(2 m L)行宏基因组测序。
1.2.1 DNA提取
肺泡灌洗液样本颠倒混匀后，使用QIAamp UCP Pathogen Mini Kit试剂盒提取DNA,50μL纯水洗脱。利用Qubit定量，DNA浓度106 ng·μL-1，通过电泳质控DNA。
1.2.2 三代测序
利用Nanopore SQK-LSK0109试剂盒进行建库，取1μg DNA直接进行DNA末端修复和接头连接，将建好的文库加入Spot ON芯片，然后将芯片放入Nanopore Grid ION测序仪进行测序，实时进行basecalling，设置每40 000条序列导出测序fastq文件。
1.2.3 二代测序
使用covaris ME220将DNA打断为350bp左右的片段。使用KAPA Hyper Prep试剂盒构建Illumina测序文库，文库扩增循环数为6个循环。文库经Qubit质控浓度、Agilent 2200 Bioanalyzer质控片段大小后，在Illumina Novaseq S4 flow cell上进行150 bp双端测序。单个样本至少产出3千万条双端150 bp测序序列。
1.2.4 微生物数据库构建
从NCBI genome数据库下载微生物(包括细菌、病毒、真菌、寄生虫)物种水平的基因组参考序列(refseq level)。使用dustmasker标记序列的低复杂度区域。删除长度<150 bp的参考序列。使用Centrifuge v1.0.3构建比对数据库。数据库共包含12 000种细菌、7 312种病毒、515种真菌、168种寄生虫。
1.2.5 数据分析
1.2.5. 1 三代测序数据实时分析
为了实时分析测序数据，搭建的流程持续扫描三代测序输出文件夹，检测到新的fastq文件后，即启动数据分析流程。流程主要包括:(1)利用minimap2将序列比对到人类参考基因组上(GRCh38);(2)将比对到参考基因组上的序列去除;(3)利用centrifuge(v1.0.3)将剩余的序列比对到微生物数据库中;(4)去除比对到不同物种的序列。为了排除常见实验及试剂污染，对空白样本进行了测序和分析，鉴定实验室以及试剂污染微生物。
1.2.5. 2 二代测序数据分析
首先对Illumina测序序列进行过滤，利用软件Trimmomatic v0.39设置滑动窗口为10bp，过滤平均测序质量值<15 bp的序列，以及序列长度<40bp的序列。过滤后的序列使用软件Bowtie v2.3.4比对到人参考基因组上(GRCh38)。去除比对到人参考基因组上的序列，使用软件centrifuge v1.0.3将剩余序列比对到微生物参考基因组数据库。去除比对到多个物种的序列，保留序列比对比例>70%的序列。
1.3 统计学方法
采用软件R 3.5.1进行统计学分析，对序列长度、测序深度以及错误率进行统计。
男，3岁6个月，因“发热10 d，咳嗽3 d”入我院感染科。入院前予盐酸伐昔洛韦治疗3 d，阿昔洛韦、头孢唑肟钠静滴治疗1 d，疗效不佳。入院后血常规:WBC10.9×109·L-1,N 0.47,L 0.30。入院后根据EB病毒检测阳性结果于第1～15 d予阿昔洛韦;第2～5 d予干扰素雾化;第2～9 d予头孢曲松;甲强龙第3～4 d 1 mg·kg-1·d-1,～11 d 2 mg·kg-1·d-1，以后逐渐减量，第15～18 d 0.5 mg·kg-1·d-1。第4～8 d经验性予阿奇霉素、第9～11 d予美罗培南。入院7 d后仍有发热，咳嗽加重，X线胸片提示左侧肺炎，胸部CT提示肺炎肺实变，呼吸科会诊后行支气管镜检查术和肺泡灌洗术，收集肺泡灌洗液，行传统方法病原检测，发现肺炎支原体检测阳性，第11～19 d调整为左氧氟沙星。治疗19 d后，体温正常，咳嗽减少，X线胸片、炎症指标好转出院，门诊随访。
2.2 传统方法病原学检测结果
肺泡灌洗液2 d普通培养阴性，腺病毒抗原检测阳性，肺炎支原体PCR定量检测阳性(1.21×104拷贝数·m L-1)。血浆PCR检测显示EB病毒阳性(4.53×103拷贝数·m L-1)。
2.3 三代测序结果
从收到样本起，DNA提取用时1.5 h，三代测序文库构建用时1.5 h(图1A)。三代测序平台允许实时分析测序数据，在测序开始12 min后，输出的第1个fastq文件中即检出腺病毒1 083条序列(图1B)，从收到样本到检出腺病毒共用时约3.2 h。测序结束后，共得到4 920 000条序列，检出99 284条腺病毒序列，占比2.02%(图2A)。图1C显示，腺病毒序列平均长度736(IQR:405～915) bp，图1D显示，宿主序列平均长度2 674(IQR:579～3 310) bp。除腺病毒外，还检出EB病毒、肺炎支原体各1条序列(图2B)。
图3A显示，三代测序序列比对到腺病毒参考基因组(NC＿011203.1)上后，覆盖度达100%,96.69%的基因组被>1 000 bp序列覆盖，平均测序深度3 165×(IQR:2 408～3 837)。
2.4 二代测序结果
测序文库构建用时4 h，从上机到测序完成用时44 h，数据拆分用时4 h。在二代测序完成后进行数据分析，数据分析耗时约2 h，从收到样本到检出腺病毒序列共用时55.5 h(包括DNA提取1.5h)。二代测序共得到15 789 245条序列，其中检出腺病毒序列共236 410条，占比1.50%(图2C)。除腺病毒外，还检出19条EB病毒序列，2条肺炎支原体序列(图2D)。
图1 三代宏基因组测序检测腺病毒
注A:三代测序检测流程;B:三代测序产出序列数和检测时间的关系，红色方框表示测序开始后产出的第1个fastq文件的时间;C:腺病毒序列长度分布;D:宿主序列长度分布
图3B显示，二代测序序列比对到腺病毒参考基因组(NC＿011203.1)上后，覆盖度达到96.62%,96.07%的基因组被>100 bp序列覆盖，平均测序深度2 214×(IQR:1 865～2 557)。
2.5 3种方法间的比较
表1显示，三代和二代测序均一次性检出3种病原(腺病毒、EB病毒以及肺炎支原体)，还检出普雷沃菌等定植菌。三代测序检出腺病毒周期最短，为3.2 h。测序成本从高到低依次为三代测序、二代测序和传统检测方法，其中传统方法肺泡灌洗液培养为人民币410元，呼吸道常规病原检测(呼吸道合胞病毒、腺病毒、偏肺病毒、副流感病毒、流感病毒的抗原检测，以及支原体、衣原体、巨细胞病毒PCR)为人民币910元，EB病毒检测(病毒抗体和PCR)为人民币470元。
图2 三代和二代宏基因组测序检出结果比较
注括号中的数字代表序列数;A:三代测序;B:三代测序结果中除腺病毒外，其余7种微生物序列数;C:二代测序;D:二代测序结果中除腺病毒外，其余5种微生物序列数
图3 腺病毒基因组范围三代和二代测序覆盖度
注A:三代测序;B:二代测序
表1 三代测序、二代测序和传统检测方法的检测结果、成本及周期比较
2.6 三代测序序列错误率
为了评估三代测序的错误率，以二代测序序列作为标准，组装腺病毒参考序列。组装完成共得到14条contig，总长36 434 bp，最长的contig长度为35 177 bp。以最长的contig为参考序列，使用blast将三代测序序列比对到参考序列后，发现三代测序序列与参考序列的平均相似度为92.8%(IQR:91.1%～95.2%)，对应三代测序序列的平均错误率为7.3%(IQR:4.8%～8.9%)。
三代与二代测序可以检出相同病原微生物，腺病毒和EB病毒在样本中的占比有差异，该差异可能是由于2种测序平台不同的建库方法以及测序原理导致的。此外，2种测序方法的污染菌株组成也不同，例如三代测序的污染菌株中存在大量的比对到大肠杆菌基因组上的序列(6 286条)，而在二代测序结果中并未发现，这些序列的长度分布(平均长度3 469 bp,IQR:3 547～3 592 bp)显著区别于腺病毒的序列(平均长度736 bp,IQR:405～915 bp)，提示该污染可能是在DNA提取步骤之后引入的。该结果为利用三代测序区分污染菌提供了新的思路。二代、三代测序较传统方法有更多的病原微生物发现。
三代(3.2 h)较二代测序(55.5 h)和传统检测方法(48h)用时更短，便于更早行合理的、有针对性的用药。三代检测费用高，但二代测序和传统检测方法在结果未报告前(45 h)的经验性用药风险大，经验性用药同样产生费用。
如果能提高病原微生物的核酸在样本中的占比，可以降低测序数据量，从而降低测序成本。此外，对病原的富集对于提高检测敏感性和降低检测周期具有重要作用[8,16]。常用的富集方法包括正向富集，例如杂交捕获、多重PCR扩增、spiked-primer扩增目标病原等，这类方法的优点是对目标病原的富集效率高，但是只能检测数量有限的特定病原[17-19]。反向富集技术是指去除宿主核酸从而提高病原核酸的占比，是目前应用最广的方法，主要步骤包括裂解宿主细胞，释放宿主核酸，用核酸酶处理宿主核酸，随后再提取病原核酸[8,20]。在临床呼吸道病原检测中应用该项技术，病原序列数量最多提高了100倍[8]。
三代测序对实验室空间、配套设备的要求较低，随着技术的不断发展以及成本的降低，其有望成为新的快速临床检测方法。
参考文献
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关键词：Nanopore测序 宏基因组测序 腺病毒 儿童呼吸道感染
呼吸道感染是导致5岁以下儿童死亡的重要原因[1,2]。呼吸道感染病原的快速、准确鉴定对于制定有效的抗生素治疗方案具有重要意义[3]。传统病原检测方法具有检测周期长、检测范围窄、阳性率低的缺点[4]。
宏基因组测序对样本中的所有微生物核酸进行测序，这种非靶向的策略可以检测所有潜在的病原，包括罕见病原或新发病原[4-6]，故被广泛应用于临床各类感染性疾病的诊断中[7-9]。宏基因组测序的平台包括Illumina(二代)和Nanopore(三代)测序。二代测序的建库步骤繁琐，测序时间长，数据不能实时分析[9-11]。三代测序具有建库时间短、测序系列长、实时数据分析的特点[8,12,13]，对于病情危重，需要尽快明确病原、疑似新发病原或者特殊病原的诊断具有重要意义[14,15]。Charalampons等[8]利用三代测序的这些特点，通过去宿主反向富集微生物核酸的方式，实现了对成人呼吸道病原6 h的快速诊断。本研究以1例重症肺炎患儿的肺泡灌洗液标本为例，比较三代测序、二代测序和传统检测方法在检测结果、时间和成本等方面的优、缺点。
1 方法
1.1 传统方法病原检测培养和菌株鉴定使用VITEK2自动分析仪完成，PCR荧光定量检测试剂盒(达安基因)检测肺炎支原体、巨细胞病毒、EB病毒，直接免疫荧光法检测腺病毒(美国Diagnostic Hybrids)，按照说明书进行操作。
1.2 宏基因组测序
宏基因检测得到复旦大学附属儿科医院(我院)伦理委员会批准(编号:2019-300)。利用患儿肺泡灌洗液样本传统检测后剩余标本(2 m L)行宏基因组测序。
1.2.1 DNA提取
肺泡灌洗液样本颠倒混匀后，使用QIAamp UCP Pathogen Mini Kit试剂盒提取DNA,50μL纯水洗脱。利用Qubit定量，DNA浓度106 ng·μL-1，通过电泳质控DNA。
1.2.2 三代测序
利用Nanopore SQK-LSK0109试剂盒进行建库，取1μg DNA直接进行DNA末端修复和接头连接，将建好的文库加入Spot ON芯片，然后将芯片放入Nanopore Grid ION测序仪进行测序，实时进行basecalling，设置每40 000条序列导出测序fastq文件。
1.2.3 二代测序
使用covaris ME220将DNA打断为350bp左右的片段。使用KAPA Hyper Prep试剂盒构建Illumina测序文库，文库扩增循环数为6个循环。文库经Qubit质控浓度、Agilent 2200 Bioanalyzer质控片段大小后，在Illumina Novaseq S4 flow cell上进行150 bp双端测序。单个样本至少产出3千万条双端150 bp测序序列。
1.2.4 微生物数据库构建
从NCBI genome数据库下载微生物(包括细菌、病毒、真菌、寄生虫)物种水平的基因组参考序列(refseq level)。使用dustmasker标记序列的低复杂度区域。删除长度<150 bp的参考序列。使用Centrifuge v1.0.3构建比对数据库。数据库共包含12 000种细菌、7 312种病毒、515种真菌、168种寄生虫。
1.2.5 数据分析
1.2.5. 1 三代测序数据实时分析
为了实时分析测序数据，搭建的流程持续扫描三代测序输出文件夹，检测到新的fastq文件后，即启动数据分析流程。流程主要包括:(1)利用minimap2将序列比对到人类参考基因组上(GRCh38);(2)将比对到参考基因组上的序列去除;(3)利用centrifuge(v1.0.3)将剩余的序列比对到微生物数据库中;(4)去除比对到不同物种的序列。为了排除常见实验及试剂污染，对空白样本进行了测序和分析，鉴定实验室以及试剂污染微生物。
1.2.5. 2 二代测序数据分析
首先对Illumina测序序列进行过滤，利用软件Trimmomatic v0.39设置滑动窗口为10bp，过滤平均测序质量值<15 bp的序列，以及序列长度<40bp的序列。过滤后的序列使用软件Bowtie v2.3.4比对到人参考基因组上(GRCh38)。去除比对到人参考基因组上的序列，使用软件centrifuge v1.0.3将剩余序列比对到微生物参考基因组数据库。去除比对到多个物种的序列，保留序列比对比例>70%的序列。
1.3 统计学方法
采用软件R 3.5.1进行统计学分析，对序列长度、测序深度以及错误率进行统计。
2 结果
2.1 病例报告男，3岁6个月，因“发热10 d，咳嗽3 d”入我院感染科。入院前予盐酸伐昔洛韦治疗3 d，阿昔洛韦、头孢唑肟钠静滴治疗1 d，疗效不佳。入院后血常规:WBC10.9×109·L-1,N 0.47,L 0.30。入院后根据EB病毒检测阳性结果于第1～15 d予阿昔洛韦;第2～5 d予干扰素雾化;第2～9 d予头孢曲松;甲强龙第3～4 d 1 mg·kg-1·d-1,～11 d 2 mg·kg-1·d-1，以后逐渐减量，第15～18 d 0.5 mg·kg-1·d-1。第4～8 d经验性予阿奇霉素、第9～11 d予美罗培南。入院7 d后仍有发热，咳嗽加重，X线胸片提示左侧肺炎，胸部CT提示肺炎肺实变，呼吸科会诊后行支气管镜检查术和肺泡灌洗术，收集肺泡灌洗液，行传统方法病原检测，发现肺炎支原体检测阳性，第11～19 d调整为左氧氟沙星。治疗19 d后，体温正常，咳嗽减少，X线胸片、炎症指标好转出院，门诊随访。
2.2 传统方法病原学检测结果
肺泡灌洗液2 d普通培养阴性，腺病毒抗原检测阳性，肺炎支原体PCR定量检测阳性(1.21×104拷贝数·m L-1)。血浆PCR检测显示EB病毒阳性(4.53×103拷贝数·m L-1)。
2.3 三代测序结果
从收到样本起，DNA提取用时1.5 h，三代测序文库构建用时1.5 h(图1A)。三代测序平台允许实时分析测序数据，在测序开始12 min后，输出的第1个fastq文件中即检出腺病毒1 083条序列(图1B)，从收到样本到检出腺病毒共用时约3.2 h。测序结束后，共得到4 920 000条序列，检出99 284条腺病毒序列，占比2.02%(图2A)。图1C显示，腺病毒序列平均长度736(IQR:405～915) bp，图1D显示，宿主序列平均长度2 674(IQR:579～3 310) bp。除腺病毒外，还检出EB病毒、肺炎支原体各1条序列(图2B)。
图3A显示，三代测序序列比对到腺病毒参考基因组(NC＿011203.1)上后，覆盖度达100%,96.69%的基因组被>1 000 bp序列覆盖，平均测序深度3 165×(IQR:2 408～3 837)。
2.4 二代测序结果
测序文库构建用时4 h，从上机到测序完成用时44 h，数据拆分用时4 h。在二代测序完成后进行数据分析，数据分析耗时约2 h，从收到样本到检出腺病毒序列共用时55.5 h(包括DNA提取1.5h)。二代测序共得到15 789 245条序列，其中检出腺病毒序列共236 410条，占比1.50%(图2C)。除腺病毒外，还检出19条EB病毒序列，2条肺炎支原体序列(图2D)。
图1 三代宏基因组测序检测腺病毒
注A:三代测序检测流程;B:三代测序产出序列数和检测时间的关系，红色方框表示测序开始后产出的第1个fastq文件的时间;C:腺病毒序列长度分布;D:宿主序列长度分布
图3B显示，二代测序序列比对到腺病毒参考基因组(NC＿011203.1)上后，覆盖度达到96.62%,96.07%的基因组被>100 bp序列覆盖，平均测序深度2 214×(IQR:1 865～2 557)。
2.5 3种方法间的比较
表1显示，三代和二代测序均一次性检出3种病原(腺病毒、EB病毒以及肺炎支原体)，还检出普雷沃菌等定植菌。三代测序检出腺病毒周期最短，为3.2 h。测序成本从高到低依次为三代测序、二代测序和传统检测方法，其中传统方法肺泡灌洗液培养为人民币410元，呼吸道常规病原检测(呼吸道合胞病毒、腺病毒、偏肺病毒、副流感病毒、流感病毒的抗原检测，以及支原体、衣原体、巨细胞病毒PCR)为人民币910元，EB病毒检测(病毒抗体和PCR)为人民币470元。
图2 三代和二代宏基因组测序检出结果比较
注括号中的数字代表序列数;A:三代测序;B:三代测序结果中除腺病毒外，其余7种微生物序列数;C:二代测序;D:二代测序结果中除腺病毒外，其余5种微生物序列数
图3 腺病毒基因组范围三代和二代测序覆盖度
注A:三代测序;B:二代测序
表1 三代测序、二代测序和传统检测方法的检测结果、成本及周期比较
2.6 三代测序序列错误率
为了评估三代测序的错误率，以二代测序序列作为标准，组装腺病毒参考序列。组装完成共得到14条contig，总长36 434 bp，最长的contig长度为35 177 bp。以最长的contig为参考序列，使用blast将三代测序序列比对到参考序列后，发现三代测序序列与参考序列的平均相似度为92.8%(IQR:91.1%～95.2%)，对应三代测序序列的平均错误率为7.3%(IQR:4.8%～8.9%)。
3 讨论
本研究探索了三代测序在1例重症肺炎患儿呼吸道感染病原快速检测中的应用。该患儿住院治疗7 d后仍有发热，咳嗽加重，X线胸片提示左侧肺炎，胸部CT提示肺炎肺实变，急需尽快明确病原以对症治疗，多种传统病原检测方法在48 h后明确病原。本研究利用三代测序在3.2 h可实现对腺病毒感染的快速诊断，并一次性检出EB病毒、肺炎支原体合并感染。体现了三代测序检测范围广、检测周期短的特点。三代与二代测序可以检出相同病原微生物，腺病毒和EB病毒在样本中的占比有差异，该差异可能是由于2种测序平台不同的建库方法以及测序原理导致的。此外，2种测序方法的污染菌株组成也不同，例如三代测序的污染菌株中存在大量的比对到大肠杆菌基因组上的序列(6 286条)，而在二代测序结果中并未发现，这些序列的长度分布(平均长度3 469 bp,IQR:3 547～3 592 bp)显著区别于腺病毒的序列(平均长度736 bp,IQR:405～915 bp)，提示该污染可能是在DNA提取步骤之后引入的。该结果为利用三代测序区分污染菌提供了新的思路。二代、三代测序较传统方法有更多的病原微生物发现。
三代(3.2 h)较二代测序(55.5 h)和传统检测方法(48h)用时更短，便于更早行合理的、有针对性的用药。三代检测费用高，但二代测序和传统检测方法在结果未报告前(45 h)的经验性用药风险大，经验性用药同样产生费用。
如果能提高病原微生物的核酸在样本中的占比，可以降低测序数据量，从而降低测序成本。此外，对病原的富集对于提高检测敏感性和降低检测周期具有重要作用[8,16]。常用的富集方法包括正向富集，例如杂交捕获、多重PCR扩增、spiked-primer扩增目标病原等，这类方法的优点是对目标病原的富集效率高，但是只能检测数量有限的特定病原[17-19]。反向富集技术是指去除宿主核酸从而提高病原核酸的占比，是目前应用最广的方法，主要步骤包括裂解宿主细胞，释放宿主核酸，用核酸酶处理宿主核酸，随后再提取病原核酸[8,20]。在临床呼吸道病原检测中应用该项技术，病原序列数量最多提高了100倍[8]。
三代测序对实验室空间、配套设备的要求较低，随着技术的不断发展以及成本的降低，其有望成为新的快速临床检测方法。
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