hsa-miR-885-5p靶基因预测及功能分析
发布时间：2021-03-10 点击：
发布：本期刊
摘 要：目的 miRNAs可以诱导心肌细胞增殖，提示miR-885-5p可能参与心脏重编程过程，本研究采用生物信息学软件预测hsa-miR-885-5p靶基因及其靶基因功能。方法 采用miRbase在线数据库和miRGator v3.0在线数据库分析hsa-miR-885-5p在各物种间保守性、进化和各个组织器官中表达情况。应用TargetScan和miRDB在线数据库预测hsamiR-885-5p靶基因；最后，用DAVID在线数据对目标靶基因进行功能富集分析和信号转导通路富集分析。结果 hsamiR-885-5p在多个物种之间具有高度保守性。在miR-885-5p家族中，人类hsa-miR-885-5p和大猩猩ppy-miR-885-5p属于同一分支；九带犰狳dno-miR-885-5p和穴兔ocu-miR-885-5p属于同一分支。hsa-miR-885-5p在肝胆系统和乳腺中表达较高。功能富集分析发现，hsa-miR-885-5p靶基因集合涉及Wnt信号通路、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调节和组蛋白去磷酸化等28个生物过程，P<0.05；富集在信使核糖核蛋白复合物、细胞质和mRNA切割因子复合物等10个细胞成份，P<0.05，并且参与蛋白质结合、组蛋白去乙酰化酶结合和RNA聚合酶Ⅱ核心启动子近端区序列特异性DNA结合等31个分子功能，P<0.05。DAVID数据库分析发现，hsa-miR-885-5p靶基因集合参与Hippo信号通路、癌症通路、背腹轴形成通路、基底细胞癌、破骨细胞分化通路、Wnt信号通路和HTLV-Ⅰ感染通路，P<0.05；其中预测靶基因在Hippo信号通路与Wnt信号通路显著富集，P<0.05。结论 hsa-miR-885-5p显著富集于肝脏并且作用于癌症通路，表明hsa-miR-885-5p在肝脏疾病，如肝癌和肝炎中起重要作用。
关键词：hsa-miR-885-5p 靶基因 功能富集分析 保守性 肝脏疾病
MicroRNA (miRNA）是一类内生的、长度约20～24个核苷酸的小RNA[1]。miRNAs可以调节基因表达，据推测，miRNA调节着人类1/3的基因，其在细胞分化、生物发育及疾病进程中发挥重要作用[2-3]。研究表明，miRNA在调节心脏细胞周期进程和再生有关的基因中扮演重要角色，例如hsa-miR-885-5p和hsa-miR-590-3p等40种miRNA可以增强心肌细胞（cardiomyocytes,CM）增殖[4-5]。Stastna等[6]检测小鼠心肌缺血再灌注心脏组织中重新分布的miRNA，发现有31个miRNA与多核糖体相关。更有趣的是，Boscaino等[7]发现miR组合可诱导心脏中非CM重编程为具有成人心室CM形态和功能的心肌样细胞，并明显改善心肌梗死后心功能。miRNAs可以诱导CM增殖，提示miR-885-5p可能参与心脏重编程过程，这可能是一个治疗心力衰竭的方向。本研究对hsa-miR-885-5p进行生物信息学分析，研究其各项功能，预测hsa-miR-885-5p靶点，为后续实验研究提供参考。
在miRbase(http：//www.mirbase.org/在线数据库搜索栏输入hsa-miR-885-5p进行物种保守性分析。
1.2 miR-885-5p在不同物种间的基因序列进化分析
使用MEGA 7.0.26对miR-885-5p在物种中的基因序列进行系统进化树分析。（1）文件转换：将miRbase中各物种miR-885-5p基因序列的txt文件在Mega上转换为fasta文件。（2）序列比对：打开fasta文件，点击Alignment，选择Align by ClustalW，各物种miR-885-5p序列首位已对齐，保存比对好的序列文件为mega format。（3）建树：打开上一步骤保存好的文件，点击Phylogeny构建进化树，使用邻接法，将options summary中的Test of Phylogeny选择为Bootstrap method，其他为默认，点击生成进化树。
1.3 hsa-miR-885-5p表达情况
通过miGator v3.0数据库（http：//mirgator.kobic.re.kr/search.html）研究hsa-miR-885-5p在各组织器官中表达情况。
1.4 hsa-miR-885-5p靶基因预测
进入TargetScan(http：//www.targetscan.org/vert＿72/）网站，在设置中specied选择为Human，输入hsamiR-885-5p得到预测基因；进入miRDB(http：//mirdb.org/cgi-bin/search.cgi?searchType=miRNA&full=mirbase&searchBox=MIMAT0004947）网站，输入hsamiR-885-5p得到预测基因，通过（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）网站绘制TargetScan和miRDB预测基因维恩图。
1.5 hsa-miR-885-5p靶基因功能富集分析和信号转导通路富集分析
采用DAVID软件（https：//david.ncifcrf.gov/）进行功能富集分析，将381个交集基因作为目的基因输入，选择基因类型为OFFICIAL-GENE-SYMBOL并且选择人类所有的基因作为背景基因[8]。
表1示，hsa-miR-885-5p保守性长度为22nt(uccauuacacuacccugccucu），人类与各物种的miR-885-5p序列相比，仅与穴兔的序列存在4个不同的碱基，与其他物种之间具有高度保守性。
表1 不同物种hsa-miR-885-5p成熟序列
2.2 miR-885-5p在不同物种间基因序列
图1示，在miR-885-5p家族中，人类hsa-miR-885-5p和大猩猩ppy-miR-885-5p属于同一分支；九带犰狳dno-miR-885-5p和穴兔ocu-miR-885-5p属于同一分支，体现了miR-885-5p在不同物种间的保守性。
图1 基于各物种的基因序列分析系统进化树
2.3 hsa-miR-885-5p表达情况
图2示，hsa-miR-885-5p在肝胆系统和乳腺中表达较高。
图2 hsa-miR-885-5p在各个组织器官中表达情况
2.4 hsa-miR-885-5p靶基因预测
TargetScan预测的hsa-miR-885-5p靶基因数量为3 081个，miRDB预测的靶基因个数为422个，2个数据库预测的靶基因通过Draw Venn Diagram在线软件共筛选出381个靶基因。
2.5 hsa-miR-885-5p靶基因功能富集分析
将381个交集基因用DAVID数据库作功能富集分析，表2示，hsa-miR-885-5p的靶基因集合涉及Wnt信号通路、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调节、组蛋白去磷酸化等28个生物过程，P<0.05；富集在信使核糖核蛋白复合物、细胞质和mRNA切割因子复合物等10个细胞成分，P<0.05，并且参与蛋白质结合、组蛋白去乙酰化酶结合和RNA聚合酶Ⅱ核心启动子近端区序列特异性DNA结合等31个分子功能，P<0.05。
表2 hsa-miR-885-5p靶基因功能富集分析部分结果
2.6 hsa-miR-885-5p靶基因的信号转导通路分析
使用DAVID数据库分析hsa-miR-885-5p的381个候选靶基因的生物途径富集。表3示，hsa-miR-885-5p靶基因集合参与Hippo信号通路、癌症通路、背腹轴形成通路、基底细胞癌、破骨细胞分化通路、Wnt信号通路和HTLV-I感染通路，P<0.05。其中预测靶基因在Hippo信号通路与Wnt信号通路显著富集，P<0.05。
表3 hsa-miR-885-5p靶基因的信号转导通路富集分析结果
本研究通过miRbase分析发现miR-885-5p在人、马、猪和猕猴等多个物种之间具有高度保守性。再将miR-885-5p通过MEGA7分析，发现人类hsa-miR-885-5p和大猩猩ppy-miR-885-5p属于同一分支，进一步体现了miR-885-5p在不同物种间的保守性。随后使用miGator v3.0数据库分析hsa-miR-885-5p在各种器官中表达，结果表明，它在肝胆系统和乳腺中高度表达。然后，通过TargetScan预测的has-miR-885-5p靶基因数量为3 081,miRDB预测的靶基因数量为422，将两个数据库预测的靶基因通过Draw Veen Diagram在线软件取交集，结果筛选出381个靶基因，其中Hippo信号通路的靶基因包括WNT5A、MOB1B、FZD10、YWHAH和TGFBR1等，与Wnt信号通路有关的靶基因包括WNT5A、FZD10、ROCK2、PPP3R1、WNT9B、NFATC2和CTNNB1等。最后，对TargetScan和miRDB筛选出来的共同靶基因进行功能富集分析发现，hsa-miR-885-5p靶基因涉及Wnt信号通路、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调节、组蛋白去磷酸化和内耳发育等28个生物过程；富集在信使核糖核蛋白复合物、细胞质和mRNA切割因子复合物等10个细胞成分；参与蛋白质结合、组蛋白去乙酰化酶结合、RNA聚合酶Ⅱ核心启动子近端区序列特异性DNA结合等31个分子功能。
预测结果显示，hsa-miR-885-5p显著富集于肝脏中，提示其可能与肝脏相关疾病有重要联系，16个靶基因（WNT5A、RET、ROCK2、TGFBR1、ARNT2、LPAR1、CTNNA3、CTNNB1、MAPK1、FZD10、RASGRP1、WNT9B、LAMC2、GNB4、HHIP和TRAF6）显著作用于癌症通路hsa05200，提示其对癌症的作用可能和上述基因有关联，但是hsa-miR-885-5p在其他途径上的机制有待进一步研究。
目前，大量研究发现，hsa-miR-885-5p可以作用于相关癌症包括直肠癌和肝癌等，而且血浆中miR-885-5p可作为胰腺癌诊断生物标志物[13-15]。在骨肉瘤中，细胞分裂周期蛋白73同源物是miR-885-5p新型直接靶点，miR-885-5p过表达可抑制骨肉瘤增殖和迁移[16]。通过微阵列分析人肝癌细胞和正常原代肝细胞发现：miR-885-5p被认为是肝癌表达下降的最大变化之一[17]。此外还有研究发现，己糖激酶2(hexokinase 2,HK2）是miR-885-5p的直接靶标，与肝癌预后相关并能控制Warburg效应，因此miR-885-5p/HK2可用于肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）治疗[18]。Wnt信号通路与Hippo信号通路失调可导致异常的细胞生长与肿瘤形成，miR302-367靶向Hippo信号激酶级联反应的多个成分以促进CM增殖[19-22];miR-139-5p可通过下调Fms相关酪氨酸激酶1表达并抑制神经胶质瘤中的Wnt/β-catenin途径而起到抑癌作用[23]。Zhang等[24]发现，miR-885-5p可抑制HCC转移并抑制Wnt/β-catenin信号通路，其中Wnt信号通路与hsa-miR-885-5p中预测的靶基因信号转导通路一致。2017年，Indersie等[25]通过体内和体外试验证明了转染miR-885-5p和miR-624-5p可有效抑制肝母细胞瘤中细胞增殖、Wnt通路活性和β-catenin表达。这与本研究预测结果相一致。而且，Li等[26]实验表明，通过促进miR-885-5p过表达可抑制星形胶质细胞上调基因1(astrocytes upregulate gene 1,AEG1）促进肝癌细胞凋亡并逆转上皮间充质转化，此研究说明AEG1是miR-885-5p的一个直接靶基因。数据集GSE29742分析发现，在嗜铬细胞瘤和副神经节瘤中miR-488和miR-885-5p过表达，是易感基因RET特异性miR-NA[27]。另一个数据集GSE29742通过微阵列分析表明，与正常组织相比，人类肝癌组织中miR-885-5p表达减少，并且其表达量下调了65.13倍，说明miR-885-5p在癌症中起重要作用[17]。
本研究仅对hsa-miR-885-5p生物信息学进行预测分析，发现hsa-miR-885-5p显著富集于肝脏并且作用于癌症通路，表明hsa-miR-885-5p在肝脏疾病，如肝癌和肝炎中起重要作用。但是与心肌纤维化有关的基因和通路，例如转化生长因子-β等并不在预测靶基因内，这与此次研究预测的初衷，hsa-miR-885-5p可能作用于心脏纤维化不一致。但是此验证结果发现了hsa-miR-885-5p真正的作用靶点，为探究miRNA作为治疗心力衰竭新药物提供了参考。但所得结果需要进一步实验验证，该分析可为hsa-miR-885-5p的未来研究提供参考，并对癌症机制研究，特别是肝癌，提供一些新思路和方向。
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关键词：hsa-miR-885-5p 靶基因 功能富集分析 保守性 肝脏疾病
MicroRNA (miRNA）是一类内生的、长度约20～24个核苷酸的小RNA[1]。miRNAs可以调节基因表达，据推测，miRNA调节着人类1/3的基因，其在细胞分化、生物发育及疾病进程中发挥重要作用[2-3]。研究表明，miRNA在调节心脏细胞周期进程和再生有关的基因中扮演重要角色，例如hsa-miR-885-5p和hsa-miR-590-3p等40种miRNA可以增强心肌细胞（cardiomyocytes,CM）增殖[4-5]。Stastna等[6]检测小鼠心肌缺血再灌注心脏组织中重新分布的miRNA，发现有31个miRNA与多核糖体相关。更有趣的是，Boscaino等[7]发现miR组合可诱导心脏中非CM重编程为具有成人心室CM形态和功能的心肌样细胞，并明显改善心肌梗死后心功能。miRNAs可以诱导CM增殖，提示miR-885-5p可能参与心脏重编程过程，这可能是一个治疗心力衰竭的方向。本研究对hsa-miR-885-5p进行生物信息学分析，研究其各项功能，预测hsa-miR-885-5p靶点，为后续实验研究提供参考。
1 资料与方法
1.1 miR-885-5p保守性分析在miRbase(http：//www.mirbase.org/在线数据库搜索栏输入hsa-miR-885-5p进行物种保守性分析。
1.2 miR-885-5p在不同物种间的基因序列进化分析
使用MEGA 7.0.26对miR-885-5p在物种中的基因序列进行系统进化树分析。（1）文件转换：将miRbase中各物种miR-885-5p基因序列的txt文件在Mega上转换为fasta文件。（2）序列比对：打开fasta文件，点击Alignment，选择Align by ClustalW，各物种miR-885-5p序列首位已对齐，保存比对好的序列文件为mega format。（3）建树：打开上一步骤保存好的文件，点击Phylogeny构建进化树，使用邻接法，将options summary中的Test of Phylogeny选择为Bootstrap method，其他为默认，点击生成进化树。
1.3 hsa-miR-885-5p表达情况
通过miGator v3.0数据库（http：//mirgator.kobic.re.kr/search.html）研究hsa-miR-885-5p在各组织器官中表达情况。
1.4 hsa-miR-885-5p靶基因预测
进入TargetScan(http：//www.targetscan.org/vert＿72/）网站，在设置中specied选择为Human，输入hsamiR-885-5p得到预测基因；进入miRDB(http：//mirdb.org/cgi-bin/search.cgi?searchType=miRNA&full=mirbase&searchBox=MIMAT0004947）网站，输入hsamiR-885-5p得到预测基因，通过（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）网站绘制TargetScan和miRDB预测基因维恩图。
1.5 hsa-miR-885-5p靶基因功能富集分析和信号转导通路富集分析
采用DAVID软件（https：//david.ncifcrf.gov/）进行功能富集分析，将381个交集基因作为目的基因输入，选择基因类型为OFFICIAL-GENE-SYMBOL并且选择人类所有的基因作为背景基因[8]。
2 结果
2.1 hsa-miR-885-5p保守性表1示，hsa-miR-885-5p保守性长度为22nt(uccauuacacuacccugccucu），人类与各物种的miR-885-5p序列相比，仅与穴兔的序列存在4个不同的碱基，与其他物种之间具有高度保守性。
表1 不同物种hsa-miR-885-5p成熟序列
2.2 miR-885-5p在不同物种间基因序列
图1示，在miR-885-5p家族中，人类hsa-miR-885-5p和大猩猩ppy-miR-885-5p属于同一分支；九带犰狳dno-miR-885-5p和穴兔ocu-miR-885-5p属于同一分支，体现了miR-885-5p在不同物种间的保守性。
图1 基于各物种的基因序列分析系统进化树
2.3 hsa-miR-885-5p表达情况
图2示，hsa-miR-885-5p在肝胆系统和乳腺中表达较高。
图2 hsa-miR-885-5p在各个组织器官中表达情况
2.4 hsa-miR-885-5p靶基因预测
TargetScan预测的hsa-miR-885-5p靶基因数量为3 081个，miRDB预测的靶基因个数为422个，2个数据库预测的靶基因通过Draw Venn Diagram在线软件共筛选出381个靶基因。
2.5 hsa-miR-885-5p靶基因功能富集分析
将381个交集基因用DAVID数据库作功能富集分析，表2示，hsa-miR-885-5p的靶基因集合涉及Wnt信号通路、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调节、组蛋白去磷酸化等28个生物过程，P<0.05；富集在信使核糖核蛋白复合物、细胞质和mRNA切割因子复合物等10个细胞成分，P<0.05，并且参与蛋白质结合、组蛋白去乙酰化酶结合和RNA聚合酶Ⅱ核心启动子近端区序列特异性DNA结合等31个分子功能，P<0.05。
表2 hsa-miR-885-5p靶基因功能富集分析部分结果
2.6 hsa-miR-885-5p靶基因的信号转导通路分析
使用DAVID数据库分析hsa-miR-885-5p的381个候选靶基因的生物途径富集。表3示，hsa-miR-885-5p靶基因集合参与Hippo信号通路、癌症通路、背腹轴形成通路、基底细胞癌、破骨细胞分化通路、Wnt信号通路和HTLV-I感染通路，P<0.05。其中预测靶基因在Hippo信号通路与Wnt信号通路显著富集，P<0.05。
表3 hsa-miR-885-5p靶基因的信号转导通路富集分析结果
3 讨论
miRNA是一类短的非编码RNA分子，通过与转录的信使RNA相互作用来影响蛋白质产生；还参与细胞发育、细胞分化和细胞周期调控过程。有研究发现，在癌症、肝炎和心血管疾病中，miRNA作为致癌或抑癌因子，通常处于异常状态[7]。由于miRNA的这一特性，已有研究使用其作为治疗肺癌等疾病的新药物，如模拟肿瘤抑制物miR-34正用于治疗癌症Ⅰ期临床试验，针对miR-122的抗miR已达到治疗肝炎Ⅱ期临床试验[9-10]。人类心脏在发生心肌梗死以及其他心脏损伤时miRNA水平也会失调。在特征明确的慢性心力衰竭（heart failure,HF）患者中，miR-132水平随HF严重程度而升高[11]。检测心肌梗死后左心室重构人群的血浆发现，细胞外小非编码RNA(exRNA）与心脏炎症和纤维化有关[12]。本研究希望找到一种有效的miRNA可以代替传统药物治疗，靶向治疗心脏疾病，逆转心脏纤维化以及促进CM增殖。本研究通过miRbase分析发现miR-885-5p在人、马、猪和猕猴等多个物种之间具有高度保守性。再将miR-885-5p通过MEGA7分析，发现人类hsa-miR-885-5p和大猩猩ppy-miR-885-5p属于同一分支，进一步体现了miR-885-5p在不同物种间的保守性。随后使用miGator v3.0数据库分析hsa-miR-885-5p在各种器官中表达，结果表明，它在肝胆系统和乳腺中高度表达。然后，通过TargetScan预测的has-miR-885-5p靶基因数量为3 081,miRDB预测的靶基因数量为422，将两个数据库预测的靶基因通过Draw Veen Diagram在线软件取交集，结果筛选出381个靶基因，其中Hippo信号通路的靶基因包括WNT5A、MOB1B、FZD10、YWHAH和TGFBR1等，与Wnt信号通路有关的靶基因包括WNT5A、FZD10、ROCK2、PPP3R1、WNT9B、NFATC2和CTNNB1等。最后，对TargetScan和miRDB筛选出来的共同靶基因进行功能富集分析发现，hsa-miR-885-5p靶基因涉及Wnt信号通路、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调节、组蛋白去磷酸化和内耳发育等28个生物过程；富集在信使核糖核蛋白复合物、细胞质和mRNA切割因子复合物等10个细胞成分；参与蛋白质结合、组蛋白去乙酰化酶结合、RNA聚合酶Ⅱ核心启动子近端区序列特异性DNA结合等31个分子功能。
预测结果显示，hsa-miR-885-5p显著富集于肝脏中，提示其可能与肝脏相关疾病有重要联系，16个靶基因（WNT5A、RET、ROCK2、TGFBR1、ARNT2、LPAR1、CTNNA3、CTNNB1、MAPK1、FZD10、RASGRP1、WNT9B、LAMC2、GNB4、HHIP和TRAF6）显著作用于癌症通路hsa05200，提示其对癌症的作用可能和上述基因有关联，但是hsa-miR-885-5p在其他途径上的机制有待进一步研究。
目前，大量研究发现，hsa-miR-885-5p可以作用于相关癌症包括直肠癌和肝癌等，而且血浆中miR-885-5p可作为胰腺癌诊断生物标志物[13-15]。在骨肉瘤中，细胞分裂周期蛋白73同源物是miR-885-5p新型直接靶点，miR-885-5p过表达可抑制骨肉瘤增殖和迁移[16]。通过微阵列分析人肝癌细胞和正常原代肝细胞发现：miR-885-5p被认为是肝癌表达下降的最大变化之一[17]。此外还有研究发现，己糖激酶2(hexokinase 2,HK2）是miR-885-5p的直接靶标，与肝癌预后相关并能控制Warburg效应，因此miR-885-5p/HK2可用于肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）治疗[18]。Wnt信号通路与Hippo信号通路失调可导致异常的细胞生长与肿瘤形成，miR302-367靶向Hippo信号激酶级联反应的多个成分以促进CM增殖[19-22];miR-139-5p可通过下调Fms相关酪氨酸激酶1表达并抑制神经胶质瘤中的Wnt/β-catenin途径而起到抑癌作用[23]。Zhang等[24]发现，miR-885-5p可抑制HCC转移并抑制Wnt/β-catenin信号通路，其中Wnt信号通路与hsa-miR-885-5p中预测的靶基因信号转导通路一致。2017年，Indersie等[25]通过体内和体外试验证明了转染miR-885-5p和miR-624-5p可有效抑制肝母细胞瘤中细胞增殖、Wnt通路活性和β-catenin表达。这与本研究预测结果相一致。而且，Li等[26]实验表明，通过促进miR-885-5p过表达可抑制星形胶质细胞上调基因1(astrocytes upregulate gene 1,AEG1）促进肝癌细胞凋亡并逆转上皮间充质转化，此研究说明AEG1是miR-885-5p的一个直接靶基因。数据集GSE29742分析发现，在嗜铬细胞瘤和副神经节瘤中miR-488和miR-885-5p过表达，是易感基因RET特异性miR-NA[27]。另一个数据集GSE29742通过微阵列分析表明，与正常组织相比，人类肝癌组织中miR-885-5p表达减少，并且其表达量下调了65.13倍，说明miR-885-5p在癌症中起重要作用[17]。
本研究仅对hsa-miR-885-5p生物信息学进行预测分析，发现hsa-miR-885-5p显著富集于肝脏并且作用于癌症通路，表明hsa-miR-885-5p在肝脏疾病，如肝癌和肝炎中起重要作用。但是与心肌纤维化有关的基因和通路，例如转化生长因子-β等并不在预测靶基因内，这与此次研究预测的初衷，hsa-miR-885-5p可能作用于心脏纤维化不一致。但是此验证结果发现了hsa-miR-885-5p真正的作用靶点，为探究miRNA作为治疗心力衰竭新药物提供了参考。但所得结果需要进一步实验验证，该分析可为hsa-miR-885-5p的未来研究提供参考，并对癌症机制研究，特别是肝癌，提供一些新思路和方向。
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