N-脒基脲二硝酰铵盐的急性毒性试验研究
发布时间：2020-09-04 点击：
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摘 要：目的 研究N-脒基脲二硝酰铵盐（FOX-12）的急性毒性。方法 急性经口毒性试验采用1 000、1 495、2 236、3 344、5 000 mg/kg 5个剂量组进行试验，每组10只SD大鼠，雌雄各5只，染毒后连续观察14天；7只日本大耳白兔分别进行皮肤刺激和眼刺激试验，皮肤刺激试验染毒后观察72 h，眼刺激试验染毒后观察7天；40只白化豚鼠进行皮肤致敏试验，分别为染毒组、阴性对照组和阳性对照组。激发24 h和48 h后分别观察对照组和试验组局部皮肤反应。结果 在14天观察期内，急性经口毒性试验染毒后第7天雌性大鼠体重差异有统计学意义（P<0.01），雌性大鼠死亡7只，雄性大鼠死亡12只，雌、雄性经口LD50分别为3 480.346和2 326.976 mg/kg，合并性别的LD50为2 845.818 mg/kg；皮肤刺激1、24、48和72 h,4只白兔均未出现红斑与焦痂，且皮肤无水肿；眼刺激试验染毒1 h后3只白兔眼睛出现明显刺激症状，到染毒后第7天症状全部消失；皮肤致敏试验激发接触后24 h和48 h，豚鼠皮肤均未出现异常。结论 FOX-12对雌、雄性大鼠急性经口属低毒，对白兔无皮肤刺激性，对眼睛具有轻度刺激性，且具有可逆性，对豚鼠皮肤不具有致敏性。
关键词：N-脒基脲二硝酰铵盐 急性经口毒性 皮肤刺激 眼刺激 皮肤致敏
N-脒基脲二硝酰胺盐（FOX-12）是瑞典国防研究院于20世纪90年代首先合成的新型钝感高能材料，其具有高能、低感、不溶于水、不吸潮、稳定性好的特点[1-3]。为满足FOX-12在武器装备中的应用需要，我国也加快了FOX-12合成和生产技术研究[4]。但是，目前FOX-12的毒性研究十分匮乏，亟待填补[5]，我们通过对FOX-12的急性毒性进行研究，为其安全生产和应用提供卫生学依据。
1.1.1 仪器与试剂
BSA124S型天平（赛多利斯科学仪器有限公司），JJ2000型天平（常熟市双杰测试仪器厂），婴儿秤（上海实干实业有限公司），YZ-5B型裂隙灯（苏州医疗器械厂）。N-脒基脲二硝酰铵盐，简称FOX-12，浅黄色晶体颗粒，西安近代化学研究所提供。荧光素钠，购自天津化学试剂一厂，其余试剂均为常规分析纯。
1.1.2 实验动物
SPF级SD大鼠50只，雌雄各25只，体重为150～190 g，动物合格证号：61001700001835，购自西安交通大学实验动物中心。普通级日本大耳白兔7只，体重为2～3 kg，动物合格证为：61001700002169，购自西安交通大学实验动物中心。普通级雌性豚鼠40只，体重300～400 g，动物合格证为：61003200000029，购自陕西省君行生物科技有限公司。动物饲养条件室温为（23±3）℃，相对湿度为40%～70%,12 h明/暗交替。试验前适应性饲养，经检疫合格后使用。试验期间，动物饲喂常规饲料，自由饮水[6-7]。
1.2 方法
1.2.1 急性经口毒性试验
根据预实验结果，在最大无作用剂量（1 000 mg/kg）和绝对致死剂量（5 000 mg/kg）之间按等比关系设5个剂量组，分别为1 000、1 495、2 236、3 344和5 000 mg/kg。每组10只，雌雄各5只。灌胃前16 h禁食但不禁水，称重后，根据体重计算灌胃量，给药量为10 m L/kg，给药后3 h恢复进食。每天观察并记录动物毒性反应、死亡情况，每周测量1次动物体重，连续观察14天。按寇氏法求受试物急性经口半数致死量（LD50）和LD50的95%CI。根据GB/T 21603-2008《化学品急性经口毒性试验方法》[8]判定受试物急性经口毒性大小。
1.2.2 急性皮肤刺激/腐蚀性试验
选择日本大耳白兔4只，试验前24 h在其两侧背部脱毛，面积约为6 cm2。每只白兔在脱毛区域染毒0.5 g FOX-12。将称量好的FOX-12用少量羧甲基纤维素均匀混合，涂抹于脱毛区域后用玻璃纸、纱布和无刺激胶布覆盖固定，4 h后洗去残留物[9-10]。于清除受试样品后的1、24、48、72 h分别观察受试部位皮肤的反应并进行评分。根据GB/T21604-2008《化学品急性皮肤刺激性/腐蚀性试验方法》[11]判定受试物对白兔皮肤刺激性。
1.2.3 急性眼刺激/腐蚀性试验
选择日本大耳白兔3只，试验前24 h，对实验动物的两只眼睛进行常规检查，确保兔子健康无眼疾。轻轻拉开实验动物右侧眼睛的下眼睑，将受试样品100 mg放入结膜囊中，使上、下眼睑被动闭合1 s，以防止受试样品丢失。未处理的左侧眼睛作为自身对照。染毒后24 h内不能冲洗眼睛。于染毒后的第1、24、48、72 h和第7天，使用裂隙灯对眼角膜、虹膜、结膜进行观察，其他损害效应记录并报告。记录眼的刺激反应，计算各观察时间点动物的眼刺激反应总分均值，根据GB/T 21609-2008《化学品急性眼刺激性/腐蚀性试验方法》[12]判定受试物对眼刺激或腐蚀作用的有无及强度。
1.2.4 皮肤变态反应（致敏）试验
选择普通级雌性豚鼠40只，试验前24 h实验动物背部左侧去毛，去毛范围为6 cm2。诱导期溶剂选择80%乙醇，激发期溶剂选择丙酮。阳性物选择2,4-二硝基氯苯。阳性物诱导浓度为0.5%，激发浓度为0.25%[13-15]。
第0天每只豚鼠在脱毛区域染浓度为1 g/mL受试物0.2 mL。将0.2 m L受试物涂布于脱毛区域，然后用玻璃纸、纱布和无刺激胶布覆盖固定6 h。
第7天和第14天在背部同一区域以第0天的方法再重复1次。
第28天在染毒组及对照组动物另一侧背部皮肤脱毛，将溶解于丙酮的受试物0.2 mL涂布于脱毛区域，然后用玻璃纸、纱布和无刺激胶布覆盖固定6 h。
激发24 h和48 h后分别观察观察对照组和试验组局部皮肤反应。对局部皮肤反应评分。对所有皮肤反应和异常，包括全身性反应、诱导和激发过程所产生的结果均进行观察和记录。将对照组与染毒组的部分实验动物皮肤进行组织病理学检查，根据GB/T 21608-2008《化学品皮肤致敏试验方法》[16]判定受试物致敏性结果。
1.3统计学分析
采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，计量资料经正态性检验后符合正态时使用±s描述，组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD法；不符合正态的资料使用中位数和四分位数间距表示，组间比较采用非参数检验。检验水准为α=0.05。
染毒后各组存活动物自主活动正常。染毒后第7天雌性大鼠体重差异有统计学意义（P<0.01),2 236 mg/kg剂量组体重显着低于1 000和1 495 mg/kg剂量组；第0天和14天雌、雄性大鼠以及第7天雄性大鼠体重比较，差异均无统计学意义（均P>0.05）。见表1。
表1 大鼠染毒后的体重情况
1 000 mg/kg剂量组大鼠在观察期内无死亡，1 495 mg/kg剂量组雄性大鼠死亡2只；2 236 mg/kg剂量组雄性大鼠死亡2只，3 344 mg/kg剂量组雄性大鼠死亡3只，雌性大鼠死亡2只，5 000 mg/kg剂量组雌、雄性大鼠全部死亡。FOX-12雌、雄性大鼠经口毒性LD50分别为3 480.346、2 326.976 mg/kg,FOX-12对SD大鼠的LD50为2 845.818 mg/kg，见表2。根据GB/T 21603-2008《化学品急性经口毒性试验方法》[8]判定FOX-12属于低毒。
表2 大鼠FOX-12经口毒性
2.2 急性皮肤刺激/腐蚀性试验
分别对染毒后各时间点大耳白兔皮肤反应进行观察。染毒后1、24、48、72 h均未观察到红斑与焦痂，且皮肤无水肿出现，4只白兔评分均为0分。根据GB/T 21604-2008《化学品急性皮肤刺激性/腐蚀性试验方法》[11]判定，FOX-12对家兔皮肤刺激性最高积分均值为0，无刺激性。
2.3 急性眼刺激/腐蚀性试验
染毒1 h后3只白兔眼睛出现明显刺激症状，主要表现为结膜充血、轻微水肿伴眼睑外翻并出现少量分泌物，角膜散在混浊，积分均值达到11.00，之后3只白兔症状逐渐减轻，到染毒后第7天，眼睛刺激症状全部消失。
染毒后1 h积分均值达到最高（11），且在第72 h总积分均值为0。根据GB/T 21609-2008《化学品急性眼刺激性/腐蚀性试验方法》[12]判定，FOX-12对日本大耳白兔眼睛具有轻度刺激性，且具有可逆性。
2.4 皮肤变态反应（致敏）试验
在激发接触后24或48 h，阴性对照豚鼠皮肤未出现异常，致敏率为0，阳性对照组豚鼠皮肤在激发接触后24 h，大部分出现明显至重度红斑，并伴有中度水肿，平均积分达到3.5，而在激发接触后48 h，皮肤反应程度呈下降趋势，阳性对照物对豚鼠皮肤的致敏率为100%，表明本实验系统可靠。
染毒组豚鼠在接触激发剂量FOX-12样品后24 h，豚鼠背部皮肤未出现异常，无红斑或水肿。综合2天观察的最高积分进行判断，豚鼠反应积分为0，致敏率为0。根据GB/T 21608-2008《化学品皮肤致敏试验方法》[16]判定，FOX-12不具有致敏性。
本研究对新型含能材料FOX-12进行了急性毒性研究，结果显示FOX-12对SD大鼠的LD50为2 845.818 mg/kg，属于低毒；皮肤刺激试验显示对白兔皮肤无刺激性；眼刺激试验对兔眼睛具有轻度刺激性，且具有可逆性；皮肤致敏试验显示对豚鼠皮肤无刺激性。提示科研生产人员在日常接触过程中应注意加强个人防护，佩戴防护目镜及手套，避免误食[18-20]。本次研究仅对急性毒性作用进行了探讨，若对FOX-12的健康危险度进行评价，还需进一步开展蓄积毒性和遗传毒性等相关研究，为制定作业场所的职业卫生标准和健康防护措施提供参考。
作者声明本文无实际或潜在的利益冲突
参考文献
[1]雷永鹏，阳世清，徐松林，等.钝感高能材料N-脒基脲二硝酰胺盐的研究进展[J].含能材料，2007,15(3):289-293.
[2]杨通辉，何金选，张海林.N-脒基脲二硝酰胺盐（FOX-12）的合成与表征[J].含能材料，2004,12(1):36-37.
[3]霍欢，轩春雷，毕福强，等.不敏感含能化合物合成最新研究进展[J].火炸药学报，2019,42(1):14-24.
[4]罗亚军，张阔，李丁，等.一种含FOX-12的低敏感发射药性能研究[J].兵器装备工程学报，2014,35(1):135-137.
[5]范小琳，高俊宏，王鸿，等.二硝酰胺铵的急性毒性[J].中国工业医学杂志，2019,32(3):204-205.
[6]卢青，高俊宏，刘志永，等.偶氮四唑二胍的急性毒性实验研究[J].职业与健康，2019,35(5):610-612.
[7]洪丽华，左派欣，杨卫超，等.甲酚皂急性毒性和致突变性试验研究[J].职业与健康，2017,33(12):1623-1625．
[8]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.化学品急性经口毒性试验方法：GB/T 21603-2008[S].北京：中国标准出版社，2008:1-2.
[9]黄海雄，庾蕾，杨淋清，等.清抗菌冻胶的刺激性和皮肤变态反应试验研究[J].职业与健康，2006,22(14):1044-1045.
[10]蒋文燕，凌娟，钟振东，等.丁香酚急性毒性和皮肤刺激试验[J].四川生理科学杂志，2015,37(2):49-51．
[11]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.化学品急性皮肤刺激性/腐蚀性试验方法：GB/T 21604-2008[S].北京：中国标准出版社，2008:2-3.
[12]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.化学品急性眼刺激性/腐蚀性试验方法：GB/T 21609-2008[S].北京：中国标准出版社，2008:2-3.
[13]梁震，黄耀师，梁虓，等.SUZUTOS豚鼠皮肤致敏GLP试验研究[J].动物医学进展，2008,29(s1):3-4.
[14]刘志永，高俊宏，李江平，等.六苄基六氮杂异伍兹烷豚鼠皮肤致敏试验[J]．职业与健康，2014,30(11):1468-1470.
[15]孙建析，洪雅青，张芳芳，等.豚鼠皮肤致敏试验随机分组模板的建立[J].职业与健康，2010,26(9):969-972.
[16]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.化学品皮肤致敏试验方法：GB/T 21608-2008[S].北京：中国标准出版社，2008:2-3.
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[18]王立宇.化学品作业职业病防护用品选用探讨[J].现代职业安全，2018(11):94-97.
[19]周林军，古文，刘济宁，等．化学品环境暴露评估模型研究进展[J].生态毒理学报，2018,13(1):61-74．
[20]谢沐文，陈亮，聂林泰，等.危险化学品检验人员安全防护措施的建立[J].检验检疫学刊，2017,27(4):55-58.
关键词：N-脒基脲二硝酰铵盐 急性经口毒性 皮肤刺激 眼刺激 皮肤致敏
N-脒基脲二硝酰胺盐（FOX-12）是瑞典国防研究院于20世纪90年代首先合成的新型钝感高能材料，其具有高能、低感、不溶于水、不吸潮、稳定性好的特点[1-3]。为满足FOX-12在武器装备中的应用需要，我国也加快了FOX-12合成和生产技术研究[4]。但是，目前FOX-12的毒性研究十分匮乏，亟待填补[5]，我们通过对FOX-12的急性毒性进行研究，为其安全生产和应用提供卫生学依据。
1 材料与方法
1.1 材料1.1.1 仪器与试剂
BSA124S型天平（赛多利斯科学仪器有限公司），JJ2000型天平（常熟市双杰测试仪器厂），婴儿秤（上海实干实业有限公司），YZ-5B型裂隙灯（苏州医疗器械厂）。N-脒基脲二硝酰铵盐，简称FOX-12，浅黄色晶体颗粒，西安近代化学研究所提供。荧光素钠，购自天津化学试剂一厂，其余试剂均为常规分析纯。
1.1.2 实验动物
SPF级SD大鼠50只，雌雄各25只，体重为150～190 g，动物合格证号：61001700001835，购自西安交通大学实验动物中心。普通级日本大耳白兔7只，体重为2～3 kg，动物合格证为：61001700002169，购自西安交通大学实验动物中心。普通级雌性豚鼠40只，体重300～400 g，动物合格证为：61003200000029，购自陕西省君行生物科技有限公司。动物饲养条件室温为（23±3）℃，相对湿度为40%～70%,12 h明/暗交替。试验前适应性饲养，经检疫合格后使用。试验期间，动物饲喂常规饲料，自由饮水[6-7]。
1.2 方法
1.2.1 急性经口毒性试验
根据预实验结果，在最大无作用剂量（1 000 mg/kg）和绝对致死剂量（5 000 mg/kg）之间按等比关系设5个剂量组，分别为1 000、1 495、2 236、3 344和5 000 mg/kg。每组10只，雌雄各5只。灌胃前16 h禁食但不禁水，称重后，根据体重计算灌胃量，给药量为10 m L/kg，给药后3 h恢复进食。每天观察并记录动物毒性反应、死亡情况，每周测量1次动物体重，连续观察14天。按寇氏法求受试物急性经口半数致死量（LD50）和LD50的95%CI。根据GB/T 21603-2008《化学品急性经口毒性试验方法》[8]判定受试物急性经口毒性大小。
1.2.2 急性皮肤刺激/腐蚀性试验
选择日本大耳白兔4只，试验前24 h在其两侧背部脱毛，面积约为6 cm2。每只白兔在脱毛区域染毒0.5 g FOX-12。将称量好的FOX-12用少量羧甲基纤维素均匀混合，涂抹于脱毛区域后用玻璃纸、纱布和无刺激胶布覆盖固定，4 h后洗去残留物[9-10]。于清除受试样品后的1、24、48、72 h分别观察受试部位皮肤的反应并进行评分。根据GB/T21604-2008《化学品急性皮肤刺激性/腐蚀性试验方法》[11]判定受试物对白兔皮肤刺激性。
1.2.3 急性眼刺激/腐蚀性试验
选择日本大耳白兔3只，试验前24 h，对实验动物的两只眼睛进行常规检查，确保兔子健康无眼疾。轻轻拉开实验动物右侧眼睛的下眼睑，将受试样品100 mg放入结膜囊中，使上、下眼睑被动闭合1 s，以防止受试样品丢失。未处理的左侧眼睛作为自身对照。染毒后24 h内不能冲洗眼睛。于染毒后的第1、24、48、72 h和第7天，使用裂隙灯对眼角膜、虹膜、结膜进行观察，其他损害效应记录并报告。记录眼的刺激反应，计算各观察时间点动物的眼刺激反应总分均值，根据GB/T 21609-2008《化学品急性眼刺激性/腐蚀性试验方法》[12]判定受试物对眼刺激或腐蚀作用的有无及强度。
1.2.4 皮肤变态反应（致敏）试验
选择普通级雌性豚鼠40只，试验前24 h实验动物背部左侧去毛，去毛范围为6 cm2。诱导期溶剂选择80%乙醇，激发期溶剂选择丙酮。阳性物选择2,4-二硝基氯苯。阳性物诱导浓度为0.5%，激发浓度为0.25%[13-15]。
第0天每只豚鼠在脱毛区域染浓度为1 g/mL受试物0.2 mL。将0.2 m L受试物涂布于脱毛区域，然后用玻璃纸、纱布和无刺激胶布覆盖固定6 h。
第7天和第14天在背部同一区域以第0天的方法再重复1次。
第28天在染毒组及对照组动物另一侧背部皮肤脱毛，将溶解于丙酮的受试物0.2 mL涂布于脱毛区域，然后用玻璃纸、纱布和无刺激胶布覆盖固定6 h。
激发24 h和48 h后分别观察观察对照组和试验组局部皮肤反应。对局部皮肤反应评分。对所有皮肤反应和异常，包括全身性反应、诱导和激发过程所产生的结果均进行观察和记录。将对照组与染毒组的部分实验动物皮肤进行组织病理学检查，根据GB/T 21608-2008《化学品皮肤致敏试验方法》[16]判定受试物致敏性结果。
1.3统计学分析
采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，计量资料经正态性检验后符合正态时使用±s描述，组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD法；不符合正态的资料使用中位数和四分位数间距表示，组间比较采用非参数检验。检验水准为α=0.05。
2 结果
2.1 急性经口毒性试验染毒后各组存活动物自主活动正常。染毒后第7天雌性大鼠体重差异有统计学意义（P<0.01),2 236 mg/kg剂量组体重显着低于1 000和1 495 mg/kg剂量组；第0天和14天雌、雄性大鼠以及第7天雄性大鼠体重比较，差异均无统计学意义（均P>0.05）。见表1。
表1 大鼠染毒后的体重情况
1 000 mg/kg剂量组大鼠在观察期内无死亡，1 495 mg/kg剂量组雄性大鼠死亡2只；2 236 mg/kg剂量组雄性大鼠死亡2只，3 344 mg/kg剂量组雄性大鼠死亡3只，雌性大鼠死亡2只，5 000 mg/kg剂量组雌、雄性大鼠全部死亡。FOX-12雌、雄性大鼠经口毒性LD50分别为3 480.346、2 326.976 mg/kg,FOX-12对SD大鼠的LD50为2 845.818 mg/kg，见表2。根据GB/T 21603-2008《化学品急性经口毒性试验方法》[8]判定FOX-12属于低毒。
表2 大鼠FOX-12经口毒性
2.2 急性皮肤刺激/腐蚀性试验
分别对染毒后各时间点大耳白兔皮肤反应进行观察。染毒后1、24、48、72 h均未观察到红斑与焦痂，且皮肤无水肿出现，4只白兔评分均为0分。根据GB/T 21604-2008《化学品急性皮肤刺激性/腐蚀性试验方法》[11]判定，FOX-12对家兔皮肤刺激性最高积分均值为0，无刺激性。
2.3 急性眼刺激/腐蚀性试验
染毒1 h后3只白兔眼睛出现明显刺激症状，主要表现为结膜充血、轻微水肿伴眼睑外翻并出现少量分泌物，角膜散在混浊，积分均值达到11.00，之后3只白兔症状逐渐减轻，到染毒后第7天，眼睛刺激症状全部消失。
染毒后1 h积分均值达到最高（11），且在第72 h总积分均值为0。根据GB/T 21609-2008《化学品急性眼刺激性/腐蚀性试验方法》[12]判定，FOX-12对日本大耳白兔眼睛具有轻度刺激性，且具有可逆性。
2.4 皮肤变态反应（致敏）试验
在激发接触后24或48 h，阴性对照豚鼠皮肤未出现异常，致敏率为0，阳性对照组豚鼠皮肤在激发接触后24 h，大部分出现明显至重度红斑，并伴有中度水肿，平均积分达到3.5，而在激发接触后48 h，皮肤反应程度呈下降趋势，阳性对照物对豚鼠皮肤的致敏率为100%，表明本实验系统可靠。
染毒组豚鼠在接触激发剂量FOX-12样品后24 h，豚鼠背部皮肤未出现异常，无红斑或水肿。综合2天观察的最高积分进行判断，豚鼠反应积分为0，致敏率为0。根据GB/T 21608-2008《化学品皮肤致敏试验方法》[16]判定，FOX-12不具有致敏性。
3 讨论
FOX-12作为低感度推进剂组分，由于其富氮、富氧，燃烧产生大量气体，是一种性能优异的气体发生剂，不仅用于推进剂，也可用于救生气囊和带状限制器中，为汽车行业和空间技术服务，应用前景广泛[17]。其主要暴露途径为吸入、皮肤接触、眼睛接触、食入，但目前国内外尚无关于其毒性的报道。本研究对新型含能材料FOX-12进行了急性毒性研究，结果显示FOX-12对SD大鼠的LD50为2 845.818 mg/kg，属于低毒；皮肤刺激试验显示对白兔皮肤无刺激性；眼刺激试验对兔眼睛具有轻度刺激性，且具有可逆性；皮肤致敏试验显示对豚鼠皮肤无刺激性。提示科研生产人员在日常接触过程中应注意加强个人防护，佩戴防护目镜及手套，避免误食[18-20]。本次研究仅对急性毒性作用进行了探讨，若对FOX-12的健康危险度进行评价，还需进一步开展蓄积毒性和遗传毒性等相关研究，为制定作业场所的职业卫生标准和健康防护措施提供参考。
作者声明本文无实际或潜在的利益冲突
参考文献
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